ELEKTROFORESIS

ELEKTROFORESIS

A. DEFINISI

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey 2000). Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik 2004). Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik (Rouessac 2007). Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Skoog 2002).

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.
Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.






B. MACAM ELEKTROFORESIS
1. Elektroforesis kertas
Sesuai dengan perkembangan ilmu bahan, elektroforesis kertas menjadi fasa pertama dari perkembangan elektroforesis zona. Dengan menggunakan medium kertas, pemisahan dan analisis terhadap asam amino, peptida, nukleotida, dan ion-ion logam yang kecil dapat dilakukan.

Kelemahan penggunaan kertas selulosa asetat adalah: adanya gangguan yang disebabkan oleh adanya gugus OH- yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah (Harjadi 1993). Kelemahan ini dapat diatasi dengan cara asetilasi gugus hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat yang tidak polar. Hal ini menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu, resolusi lebih baik, dan proses pemisahan berlangsung lebih cepat.

Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah:
• proses migrasi lebih cepat
• pemisahan spot menjadi lebih kecil
• mudah memisahkan sampel dengan spektrofotometri
• mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit.
Pada elektroforesis kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkan dengan cara kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya dan spotnya lebih kecil daripada cara basah. Oleh karena itu, percobaan ini menggunakan medium selulosa asetat.

2. Elektroforesis gel
Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel.
Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah.
C. MEDIUM PENDUKUNG
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu.
Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.

1. Cellulose asetat

2. Larutan Buffer
Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :
a. Komposisi
Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.
b. Konsentrasi
Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M.
c. pH
Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa.

3. Medan elektrik
Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium.
a. Voltase
Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.
b. Aliran listrik
Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya.
c. Tahanan
Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.

D. KOMPONEN UTAMA ALAT
1. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer dengan pH tertentu.
2. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa kertas(selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan, agar-agar.
3. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.


























E. PERCOBAAN
1. ELEKTROFORESIS KERTAS
TUJUAN
a. Menunjukkan bagaimana komponen dalam senyawaan campuran dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis
b. Menunjukkan bahwa beberapa indikator dan beberapa pigmen pada tinta adalah molekul yang dapat terionisasi, dan menunjukkan keuntungan elektroforesis menggunakan kertas selulosa asetat.

ALAT DAN BAHAN
• elektroforesis 200 volt DC (30 menit) dan 150 volt DC (90 menit)
• kertas selulosa asetat
• bufer amonia dan amonium asetat atau bufer asam asetat dan amonium asetat
• tinta warna hitam
• indikator congo red, fenol red, brom fenol blue, dan campuran ketiganya, zat warna fluorecein, tartrazine, dan campuran keduanya, dan pewarna makanan sintetik sunset yellow dan poncean.

CARA KERJA
1. Kertas elektroforesis atau kertas selulosa asetat dipotong dengan ukuran 30 x 10 cm sebanyak 3 buah untuk tinta dan pewarna makanan, indikator, dan zat warna.
2. Kertas diberi garis vertikal di bagian tengah kertas sebagai tanda garis start.
3. Spot dibuat dengan baik.
4. Kertas kemudian dimasukkan ke dalam larutan bufer dan ditempatkan ke dalam alat elektroforesis, dirunning dengan potensial 200 v dan 150 v selama 30 menit dan 90 menit.
5. Pemisahan yang terjadi diamatai dengan interval 5 – 10 menit.
6. Pemisahan dan warna yang teramati dicatat.
7. Setelah 30 menit dan 90 menit, arus dimatikan dan kertas diangkat dari alat tersebut.
8. Bukti kertas hasil pemisahan disimpan untuk dokumentasi dan dicetak untukbahanlaporan.



2. ELEKTROFORESIS GEL
TUJUAN
Melakukan elektroforesis DNA menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa.
BAHAN DAN ALAT
• DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII
• Sampel DNA, misalnya :
• DNA kromosom bakteri,
• DNA plasmid hasil isolasi (uncut)
• DNA plasmid hasil restriksi (cut)
• Agarosa
• Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)
• Akuades
• Gelas Ukur 1000 ml
• Labu Erlenmeyer 50 ml
• Tabung mikrosentrifuga
• Sarung tangan
• Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
• Kertas parafilm
• seperangkat alat elektroforesis
• Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM)
• larutan Etidium Bromid (EtBr)
• UV transluminator
• Kaca mata UV
• kamera digital

CARA KERJA
1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.
2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.
3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)
4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki
5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).
6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.
7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).
9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.
11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.
14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.
15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.
16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).
17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.