MEDIA PERBENIHAN

Media perbenihan

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai kebutuhan bakteri. Oleh karena bakteri yang berbeda memerlukan kebutuhan akan nutrisi yang berbeda pula , sehingga dikembangkan berbagai macam media pertumbuhan untuk digunakan dalam diagnosa mikrobiologi.

Media perbenihan terdiri dari dua bentuk yaitu bentuk cair dan padat (agar). Pada media cair, bahan-bahan gizi dilarutkan dalam air sehingga pertumbuhan bakteri ditandai dengan perubahan warna madia menjadi keruh, semakin banyak bakteri tumbuh akan semakin keruh larutan. Diperlukan jumlah bakteri 10⁶ sehingga dapat terlihat adanya pertumbuhan tanpa mikroskop. Media padat dibuat dengan penambahan bahan pengeras pada campuran bahan gizi dan air. Biasanya digunakan agarosa yang memiliki sifat cair pada suhu ≥ 95⁰C tetapi berbentuk padat pada suhu dibawah 50⁰C. Dengan kondisi inkubasi yang sesuai bakteri dapat tumbuh dan berkembang dalam jumlah yang banyak sehingga dapat dilihat tanpa menggunakan mikroskop. Pertumbuhan bakteri membentuk kelompok yang terdiri dari satu jenis bakteri yang disebut koloni, dengan kata lain dalam satu koloni adalah bakteri yang sama genus dan spesiesnya memiliki karakteristik gen dan fenotip yang sama. Pembiakan bakteri yang terdiri dari satu macam koloni yang seragam disebut dengan pembiakan murni. Pembiakan yang murni diperlukan untuk identifikasi bakteri, untuk memudahkan pengambilan koloni yang sama ketika ditanam pada media identifikasi

Bahan-bahan media pertumbuhan

1. Bahan dasar

a. Air (H2O) sebagai pelarut

b. Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45⁰C.

c. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.

d. Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.

2. Nutrisi atau zat makanan

a. Nikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg

b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.

c. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain dan sejumlah vitamin.

3. Bahan tambahan

Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.

4. Bahan lain yang sering digunakan dalam pembuatan media

a. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.

b. Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa, plasenta dan daging sapi.

c. Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (Bcomplex).

d. Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.

Klasifikasi dan fungsi media:

1. Medium berdasarkan sifat fisik

Ø Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelahdingin media menjadi padat..

Ø Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semisolid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Ø Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth),TSB (Trypticase Soy Broth)

2. Medium berdasarkan komposisi

Ø Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

Ø Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak

dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

Ø Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahandasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan

Ø Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

Ø Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Saltbroth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.

Ø Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, buffer charcoal yeast extract agar yang mengandung L-cystein dan bahan gizi lain untuk pertumbuhan legionella pneumophila penyebab penyakit legionnair.

Ø Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

Ø Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth,Arginine Agar.

Ø Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari bakteri lainnya yang sama-sama tumbuh dalam media perbenihanberdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni, media Mac conkey agar merupakan media diferensial dan slektif karena tidak dapat menumbuhkan bakteri gram positif.

Dari sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk identifikasi bakteri adalah :

1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair.

BHI adalah media penyubur yang berguna untuk pertumbuhan berbagai macam bakteri baik bentuk cair maupun agar. Bahan utama terdiri dari beberapa jaringan hewan ditambah pepton, buffer posfat, dan sedikit dekstrosa. Penambahan karbohidrat memungkinkan bakteri dapat menggunakan langsung sebagai sumber energi. BHI biasanya digunakan untuk media pertumbuhan spesimen darah

2. Perbenihan cair Gram negative (GN broth).

Media selektif gram negatif digunakan untuk pembiakan bakteri patogen saluran pencernaan ( salmonella spp dan shigella spp) dari spesimen faeces dan rectal swab. Larutan berisi beberapa bahan aktif termasuk natrium sitrat dan natrium deoksikolat yang menghambat pertumbuhan organisme gram positif dan mempercepat pertumbuhan bakteri gram negatif. Untuk mengoptimalkan selektfitas media, GN broth setelah diinkubasi 6-8 jam setelah penanaman pertama harus diisolasi ulang dan diinkubasikan kembali, apabila melewati waktu tersebut bakteri nonenterik patogen akan tumbuh melampaui pathogen

3. Columbia CNA mengandung darah

Agar Columbia CAN adalah media dasar yang mengandung tiga komponen sumber pepton dan darah domba 5% yang tidak mengandung fibrin. Media ini juga dapat membedakan reaksi bakteri berdasarkan kemampuan dalam menghemolisa darah. CNA adalah merupakan antibiotic Colistin (C) dan Nalidixic acid (NA) yang ditambahkan ke dalam media untuk menghambat mikroorganisme gram negatif dan menumbuhkan bakteri gram positif. Contohnya untuk perbenihan Lactobacillus spp dari specimen secret vagina, streptococcus yang menyebabkan infeksi pada vagina dan wanita hamil.

4. Hektoen Enteric agar (HE)

Terdiri dari garam empedu dan zat warna indikator (brom thymol blue dan fuchsin acid) untuk memperlambat bakteri non patogenik gram negatif batang yang terdapat di saluran pencernaan dan memberi kesempatan salmonella dan shigella tumbuh. Media HE juga merupakan media differensial karena bakteri non enterik patogen akan tumbuh koloni berwarna oranye sampai merah muda kekuningan. Koloni ini timbul dari organisme yng memiliki kemampuan menfermentasi laktosa dalam media, kemampuan meragi menghasilkan asam yang akan menurunkan pH media dan meyebabkan perubahan indikator bromthymol blue. Shigella tidak meragi laktosa sehingga sehingga warna media biru kehijauan tidak berubah seperti karakteristik media diferensial, media mengandung feri ammonium sitrat yang mendeteksi adanya produksi gas H₂S seperti salmonella spp. Dapat terlihat melalui adanya presipitasi warna hitam pada media.

5. Mac conkey agar

Mac conkey agar adalah media selektif dan differensial yang paling sering digunakan. Media ini terdiri dari zat warna Kristal violet untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan jamur dan memungkinkan beberapa macam bakteri gram negatif batang tumbuh , netral red sebagai pH indikator memberikan warna pink sampai merah pada koloni misalnya salmonella spp. Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa misalnya shigella spp memberikan warna koloni jernih transparan

Gambar 1. Media Mac conkey (meragi laktosa/kiri) dan (tidak meragi laktosa/kanan)

6. Phenyl ethyl alcohol (PEA)

PEA adalah agar darah domba yang ditambahkan phenyl etil alcohol untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif darah domba 5% dalam PEA menyediakan kebutuhan nutrisi untuk bakteri gram positif coccus seperti enterococcus, streptococcus dan staphylococcus

7. Perbenihan cair tioglikolat

Perbenihan cair tioglikolat adalah media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi seperti casein, ragi dan ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat pertumbuhan , bahan lain yang ditambahkan indikator oksidasi-reduksi (resazurin), dextrose, vitamin K1 dan hemin biasa ditambahkan pada media modifikasi thayer martin sebagai tambahan pada media ditambahkan 0,075% untuk mencegah pengaruh oksigen langsung terhadap larutan , bahan tambahan ini diberikan untuk memberikan suasasana anaerob pada bagian dasar tabung sehingga bakteri anaerob dapat tumbuh

8. Agar darah

Gambar 2. Agar darah steril (kiri), α- hemolisa (tengah) dan β-hemolisa (kanan)

Agar darah merupakan media yang paling banyak digunakan unuk penanaman bakteri yang sukar tumbuh karena pada agar darah domba mengandung nutrisi yang dibutuhkan bakteri. Kemudian pula koloni yang tumbuh pada media ini biasanya spesifik dan mudah dikenali. Media pada dasarnya terdiri dari sumber protein(pepton), protein kedelai olahan (mengandung KH),NaCl, agar dan darah domba 5%. Bakteri penghasil enzim ekstraseluler yang dapat melisiskan sel darah merah domba pada agar (hemolisis). Aktifitas ini ditandai dengan adanya zona jernih disekeliling koloni (beta hemilisis), kehijauan (alpha hemolisis) dan untuk bakteri yang tidak menghemolisa darah tidak terjadi perubahan pada sekeliling koloni bakteri ( gamma /non hemolisis)

9. Agar coklat dan Thayer martin

Agar coklat sama seperti agar darah tetapi pada agar coklat darah yang digunakan di lisiskan terlebih dahulu sebelum dimasukan ke larutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit mengeluarkan bahan-bahan intraseluler seperti haemoglobin, hemin,dan koenzim nicotinamide adenine dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh bakteri yang sukar tumbuh. Darah yang lisis memberikan warna coklat pada media sehingga disebut dengan agar coklat. Biasanya bakteri patogen yang tumbuh pada media agar coklat yaitu: Neisseria meningitidis ,Haemophilus spp (terlibat dalam infeksi saluran pernafasan dan telinga)

Agar Thayer martin

Thayer martin agar adalah media diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae. Penambahan antibiotik colistin bertujuan untuk menghambat bakteri gram negatif, vancomisin untuk menghambat bakteri gram positif dan nistatin menghambat pertumbuhan ragi. Antibiotik trimetropin jugsa ditambahkan untuk menghambat perumbuhan Proteus spp, dan bakteri lainnya yang akan tumbuh menyebar di seluruh permukaan agar dan dapat meghalangi koloni bakteri yang akan diidentifiasi Neisseria spp. pada mredia modifkasi Thayer martin lewis, antibiotik nistatin diganti dengan ansamisin

Sterilisasi media

Bahan media yang telah dilarutkan , baik media cair maupun untuk meda pdat harus dilakukan terlebih dahulu melalui proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121⁰C (250⁰F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi² (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan selama 15 menit. dan waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah mencapai 121⁰ C . Setelah di autoclave media harus mencapai suhu sekurangnya 50 ⁰C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya 25 ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahan-bahan seperti darah, antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar dingin sebelum dituang ke cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan panas dapat dilakukan sterilisasi dengan cara filtrasi membran